উপেন্দ্রকিশোর রায়চৌধুরীর জন্ম ১৮৬৩ সালের ১২ মে ময়মনসিংহ জেলার মসূয়া গ্রামে, যা বর্তমান বাংলাদেশে অবস্থিত। তার পিতা কালিনাথ রায় ছিলেন আরবি, ফারসি ও সংস্কৃতে সুপণ্ডিত। তার ডাকনাম ছিল শ্যামসুন্দর মুন্সী।
মেধাবী ছাত্র বলে পড়াশোনায় ভালো ফল করলেও ছোটবেলা থেকেই উপেন্দ্রকিশোরের পড়াশোনার চেয়ে বেশি অনুরাগ ছিল বাঁশি, বেহালা ও সংগীতের প্রতি। ময়মনসিংহ জিলা স্কুল থেকে উপেন্দ্রকিশোর প্রবেশিকা পরীক্ষা উত্তীর্ণ হয়ে বৃত্তি পান। তারপর কলকাতায় এসে ভর্তি হন প্রেসিডেন্সি কলেজে।
উপেন্দ্রকিশোর ছাত্র থাকাকালীনই ছোটদের জন্য লিখতে আরম্ভ করেন। তিনি একাধারে লেখক, চিত্রকর, প্রকাশক, শখের জ্যোতির্বিদ, বেহালাবাদক ও সুরকার ছিলেন। এ ছাড়া তিনি ছিলেন বাংলা ছাপাখানার অগ্রপথিক। ‘সন্দেশ’ পত্রিকা তিনিই শুরু করেন, যা পরে তার পুত্র সুকুমার রায় ও পৌত্র সত্যজিৎ রায় সম্পাদনা করেন। গুপি-গাইন-বাঘা-বাইন, টুনটুনির বই ইত্যাদি তারই অমর সৃষ্টি।
১৯১৫ সালের ২০ ডিসেম্বর মাত্র ৫২ বছর বয়সে উপেন্দ্রকিশোর পরলোক গমন করেন।